一、非酒精性脂肪性肝病流行病学现状非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的代谢应激性肝损伤,是导致肝功能转氨酶异常和慢性肝病最常见的原因。欧美等发达国家成人NAFLD患病率为20%~33% ,其中非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化分别占10%~20%和2%~3%。肥胖者NAFLD患病率60%~90%。2型糖尿病和高脂血症患者NAFLD患病率分别为28%~55%和27%~92%。我国城市人口抽样调查表明,成人NAFLD患病率在15%左右(6.3%~27%)。目前脂肪肝已替代乙肝成为我国第一大肝病,随着生活方式的西化及肥胖、糖尿病等代谢综合征患病率的上升,NAFLD患者增长迅速且呈低龄化发病趋势,而人们往往未引起足够重视。二、非酒精性脂肪性肝病的危害我国至少有15%以上人群患有不同程度NAFLD。40岁以上长期饮酒、高脂饮食、营养过剩、缺乏运动、肥胖是脂肪肝患病的危险因素,而患有高血压、高血脂、糖尿病等疾病人群则更易发生脂肪肝。脂肪肝非良性预后疾病,也可引起肝硬化甚至肝癌等不良后果。如NASH患者10~15 年内肝硬化发生率达15%~25%。脂肪性肝病分为四个不同阶段:即单纯性脂肪肝,脂肪性肝炎,脂肪肝相关肝硬化和肝细胞癌。NASH患者肝细胞癌患病率高达2.8%。脂肪肝又常与肥胖、高脂血症、糖尿病和高血压等发病有关。脂肪肝主要危害:①肝脏:可逐步发展为脂肪性肝炎→肝硬化→肝癌。②心血管:合并脂肪代谢异常,可促进动脉粥样硬化形成,还可诱发和加重高血压、冠心病。③诱发或加重糖尿病及其并发症的发生,影响消化吸收功能,诱发胆囊疾病,降低生活质量,影响工作。④可使患者预期寿命缩短,主要死亡原因为心血管疾病和恶性肿瘤。三、重视和规范治疗脂肪性肝病刻不容缓 由于公众对脂肪肝危害程度的认知普遍不足,部分临床医师缺乏对该疾病的规范化治疗,使得众多脂肪肝患者一步步演变成脂肪性肝炎、肝纤维化,严重时导致肝硬化肝癌及相关并发症的发生,大大降低生活质量,严重危害生命健康。专病专治是目前临床医学中一种有效的方式,基于目前脂肪肝发展现状和存在问题,脂肪肝的预防和规范化治疗已迫在眉睫,作为苏州拥有知名度的肝病特色专科医院,为解决广大患者疾病困扰,苏州市第五人民医院特开设脂肪肝专科特色门诊,由肝病专家童博士主诊,以更专业地为脂肪肝患者提供及时、有效、规范的医疗服务。脂肪肝专科特色门诊时间:每周一全天(8:00~15:30) ※ 苏州市第五人民医院脂肪肝专科特色门诊宣
现在物质生活水平大大提高了,饮食结构发生了非常大的变化,鱼肉已常出现在人们的餐桌。但“多食肥甘”在为人们带来莫大口福的同时,也带来了一些意想不到的祸患,脂肪肝就是其中之一。脂肪肝现在已成为贻害青壮年的常见病,令人忧虑的是,许多人肝脏发生病变却浑然不知。就算体检查出了脂肪肝,也因为没有症状而不当回事。到底脂肪肝有什么危害?肝脏发胖了,只靠节食加运动就可以吗?你的肝脏发胖了?脂肪肝又称“肝内脂肪变性”,健康人群肝脏的脂肪含量约占肝脏重量的5%,当肝脏脂肪重量超过肝脏重量的5%就是脂肪肝了,超过15%是中度脂肪肝,超过30%是重度脂肪肝。脂肪肝的脂肪并不存在于肝脏的表面,而是充斥在肝细胞里面,脂肪太多会损害肝细胞,甚至使肝细胞膜破裂形成肝硬化,严重的可发展为肝癌。导致脂肪肝的危险因素主要有:●经常大鱼大肉,或摄入过多淀粉类和糖分,运动又太少;●长期饮酒导致酒精中毒,致使肝内脂肪氧化减少。嗜酒者中,超过半数会发生脂肪肝,20%-30%最终将发展为肝硬化;●肥胖、糖尿病、肝炎;●某些药物引起的急性或慢性肝损害。危害脂肪肝患者易得“三高”脂肪肝病起病隐匿,轻度甚至中度脂肪肝没有明显的临床症状,重度脂肪肝可出现疲乏感、食欲不振、恶心、腹胀、肝区隐痛等症状,很容易被忽略,一般是在体检做B超 时偶然发现的。上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科曾民德教授指出:“相当部分患者不把脂肪肝当回事,以为脂肪肝不是真正的疾病,无需治疗。其实,脂 肪肝不仅是一种独立疾病,还会引起多种共病的产生。脂肪肝长期得不到控制,不仅损害肝脏,引起肝硬化,患者的血糖、血脂代谢等都会受到严重影响。脂肪肝患 者的高血糖、高血压和高脂血症的发病率与常人相比提高了一到两倍,最终可导致或加快糖尿病、冠心病、中风等心脑血管疾病的发生和进展。”可以说,脂肪肝是全身脂代谢紊乱的一个窗口,有数据显示,有45%的脂肪肝患者合并代谢综合征(腹部肥胖、血压升高、血糖异常、血脂紊乱等)。另外,患有脂肪肝的病人,其体内存在胰岛素抵抗、糖代谢紊乱,经常处于高血糖状态。因此,脂肪肝已经成为2型糖尿病的一个高危因素。值得庆幸的是,脂肪肝属于可逆性疾病,早期诊断并及时干预,大多患者可恢复健康。
李经理10年前就开始发胖,查体发现有脂肪肝和转氨酶轻度增高,乙肝标志阴性,自认为只是脂肪肝,没什么大不了的,发胖是福。因此,他根本不重视,虽然医生建议他要戒酒和减肥,然而“人在江湖、身不由已”,烟酒应酬,大吃大喝仍是家常便饭,结果肥胖和脂肪肝程度越来越重。最近终因发展成肝硬化,并发食管静脉曲张破裂大出血急症住院,虽经积极抢救仍未能挽救生命。也许,在某次健康体检中,你被告知得了脂肪肝,不知该如何是好。也许,你已经患脂肪肝多年,一直都不见好,有点灰心。也许,你还没得脂肪肝,但已有医生警告你,脂肪肝离你不远了。也许,你曾听人说,脂肪肝是富贵病,不痛不痒,没啥害处,不需要治。也许,你曾听人说,脂肪肝若不好好治,也会变肝硬化、肝癌,有点恐惧。……1 何谓脂肪肝脂肪性肝病(FLD)是遗传-环境-代谢应激相关性疾病,包括酒精性肝病(ALD)和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)两大类。当前ALD的患病率居高不下,而NAFLD的发病率不断攀高且起病渐趋低龄化,已成为发达国家和地区慢性肝病第一大病因,并且,ALD与NAFLD、FLD与病毒性肝炎可以合并存在。更为严峻的是,NAFLD除了与ALD一样可导致肝病残疾和死亡外,还与2型糖尿病、代谢综合征及其相关心脑血管事件密切相关。2 脂肪肝的流行世界卫生组织在报告中表示,由于饮食不健康、生活方式不科学等诸多因素,世界肥胖人口激增。该组织预测,到2015年,世界肥胖人口总数将由2005年的、16亿迅速膨胀至23亿。全球60亿人口中,按NAFLD流行率20%,有12亿患NAFLD,按NAFLD 5年生存率67%计算,每年因NAFLD死亡达8000万。肥胖症患者约50%合并有脂肪肝,国内某项调查发现10个肥胖者中甚至8个有脂肪肝。我国是病毒性肝炎大国,但在乙肝疫苗计划免疫接种后病毒性肝炎的发病率将大幅下降,而与代谢综合征相关的非酒精性脂肪性肝病的发病率在10年内将有大幅上升,肥胖对脂肪肝的影响比过量饮酒更为严重,目前日益增多的为非酒精性脂肪肝,并且呈低龄化和大众化趋势,已严重威胁到人民健康。我国脂肪肝的患病率为17%左右,其中90%的为非酒精性脂肪肝,脂肪肝已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病,约2.5%~5%的患者可发展为肝硬化。随着肥胖症和糖尿病的流行,国人脂肪肝患病率增长迅速。儿童肥胖率、超重率正以每5年翻一倍的速度增长,儿童NAFLD也正成为儿童青少年突出问题之一。3 脂肪肝的危害脂肪肝早期症状较轻或无症状,因而经常被忽视。这种隐匿性使一些人的脂肪肝发展到严重的程度时才刚刚发现,得不到及时有效治疗。这是因为肝脏不善于抱怨,它的代偿能力很强,通常只有30%的肝细胞在执行功能。与其他肝病不同,肥胖相关脂肪肝的危害并不仅仅局限在肝脏,肝脏肥胖(脂肪肝)对全身的影响通常比肝病本身还要严重。就肥胖对全身健康的影响而言,中国人比欧美人种更不耐胖,体重和腰围轻度增加时就会造成糖脂代谢紊乱。体内脂肪含量比单纯体重增加(体重指数),腹部内脏脂肪(腰围)比臀部皮下脂肪(臀围),异位沉积在肝脏的脂肪(脂肪肝)比脂肪组织内的脂肪,更易引起脂肪中毒和代谢综合征。脂肪肝与代谢紊乱互为因果,两者之间存在恶性循环。俗话说“胖人体虚,胖肝易损”。弥漫性脂肪肝为成人查体最常见的肝病,并是肝酶异常的主要原因。轻微的体重增长以及低体重指数和低腰围就可导致代谢紊乱和脂肪肝。脂肪肝对人体的危害,主要是使脂类代谢、运转发生障碍,能量代谢紊乱,使机体免疫功能大大下降。脂肪肝还可能会引起激素代谢紊乱,男性出现女乳化、睾丸萎缩、性功能下降;女性雄性激素升高,月经不调甚至不孕。因此,脂肪肝是一个潜在的终生性疾病,可以累及心血管、呼吸、内分泌、胃肠、泌尿、神经、肌肉骨骼、皮肤脂肪组织、免疫等全身9个系统。脂肪长期在肝内过度蓄积,肝脏血液供应、氧气供应及自身代谢受到持续影响,就会造成脂肪性肝炎,使肝细胞大量肿胀、炎症浸润及变形坏死。更为可怕的是,非酒精性脂肪肝与酒精性脂肪肝相似,均可导致肝硬化、肝细胞癌和肝功能衰竭。据目前国内资料,脂肪性肝炎的纤维化发生率约为25%,近8%的患者最后发展成为肝硬化。而积极治疗肥胖和减轻肝脂肪沉积对于慢性肝病合并脂肪肝患者往往伴随肝脏损伤的减轻以及进展性肝纤维化的改善。另外,脂肪肝对其他肝病的影响,国外可能为肝脏铁负荷过重促进NASH的发病以及肝脂肪变促进慢性丙型肝炎肝纤维化的进展并影响其对干扰素的抗病毒治疗应答。而国内可能为肝脂肪变影响慢性乙型肝炎的转归以及促进药物与毒物性肝病的发生。事实上,脂肪沉积的肝脏对药物、环境毒素、缺血和缺氧的敏感性增强,脂肪肝患者比正常人更易发生药物与中毒性肝病以及外科手术后肝脏损伤。更为严峻的是,肥胖相关的非酒精性脂肪肝除可直接导致肝病相关残疾和死亡外,还与糖尿病、动脉硬化性心脑血管疾病,并增加慢性乙肝患者肝硬化和肝癌的发病率。脂肪肝是威胁我国人民健康的一种重要疾病,防治脂肪肝已成为当代医学领域的新挑战。4 脂肪肝的防治鉴于肥胖症和脂肪肝对人类健康的巨大危害,因此,关注健康,不能忽视脂肪肝。只有高度重视脂肪肝的危害,才能采取有效措施最大程度地防治其损害。建议人们保持健康的生活方式,控制体重和减少腰围,注意检查和治疗,是减少肝病和增进健康的一条有效捷径。脂肪肝的防治原则可概括为:①去除病因和诱因,积极处理原发疾病或伴随疾病;②调整饮食方案、纠正营养失衡;③坚持必要的体育锻炼以维持理想的体重;④自我保健意识的教育以纠正不良行为;旨在维持相对正常的血脂、血糖水平以及胰岛素敏感性,促进肝内脂肪消退;⑤必要时辅以保肝药物,以预防单纯性脂肪肝发生脂肪性肝炎,并促进脂肪性肝炎康复。然而如果不能及时去除病因和诱因,则用再好的保健品和药物也不可能有效阻止肝病进展。积极治疗肥胖和减轻肝脂肪沉积对于慢性肝病合并脂肪肝患者往往伴随肝脏损伤的减轻以及进展性肝纤维化的改善。像本文中的李经理如能听从医生的劝告,及时戒酒和减少应酬,避免酒精中毒和肥胖,肯定不会因肝硬化而英年早逝。另请注意,脂肪肝并非胖人的专利,瘦人也不是不可以患脂肪性肝病。本人从事肝病脂肪肝门诊多年,发现不少令人痛心的脂肪肝晚期相关病例,故撰此文。望各位朋友不能再无动于衷了,现在就行动起来!,积极防治脂肪肝,提高生活质量,让生活更健康、更美好! (苏州市第五人民医院肝病研究所 童福易) 2011/2/26
[摘要] 目的:探讨甘露糖结合蛋白(MBP)基因突变与慢性及重型乙型肝炎的相关性。方法:采用基因扩增和DNA测序方法检测了64例健康人和52例慢性乙肝及62例重型乙肝患者MBP基因第一外显子的DNA序列,然后与GeneBank中参照序列进行比较分析。结果:三组人群中MBP基因仅存在密码子54突变,而无密码子52、57的突变。健康人、慢性乙肝和重型乙肝组密码子54突变率分别为14.1%(9/64)、15.4%(8/52)和35.5%(22/62),前两组间比较无统计学差异(P>0.05),而重型乙肝组密码子54突变率则分别显著高于前两组(χ2=7.79,P<0.01;χ2=5.89,P<0.05)。结论:该地区乙肝人群MBP基因仅存在密码子54突变, 突变与乙肝慢性化无明显关系,而与重型肝炎的发生有显著相关性。故监测MBP基因突变可作为重型肝炎判断预后的一个可行性指标。[关键词] 甘露糖结合蛋白;基因突变;乙型肝炎;慢性;重型Relationship between the gene mutations of mannose binding protein and the progression of hepatitis B infection。TONG Fu-yi*, GAN Jian-he. *Institute of Hepatology, Suzhou Fifth People’s Hospital, Suzhou 215007Corresponding author: TONG Fu-yi, E-mail: tongfy@163.com[Abstract] Objective To understand the relationship between the gene mutations of mannose binding protein(MBP) and the progression of hepatitis B. Methods The MBP gene mutations in 52 patients with chronic hepatitis B and 62 patients with severe hepatitis B and 64 HBsAg-negative healthy controls were investigated. The mutations in MBP gene were analysed by polymerase chain reaction (PCR) assay and direct DNA sequencing. Results At MBP gene mutations in codons 52, 54 and 57,only a mutation in codon 54 was found. The mutation frequency in group of severe hepatitis B (35.5%, 22/62) was higher than in group of chronic hepatitis B (15.4%, 8/52) and HBsAg-negative healthy controls(14.1%,9/64),respectively, and their difference was significant (χ2=7.79,P<0.01;χ2=5.89,P<0.05). The difference of in group of chronic hepatitis B and in group of HBsAg-negative healthy controls was no significant (p>0.05). Conclusions There is only mutation in codon 54 of the MBP gene in patients with hepatitis B infection in the area.Codon 54 mutation of MBP is not related to the persistence of hepatitis B,but it was associated with progression of hepatitis B infection.[Keywords] mannose binding protein; gene mutation; hepatitis B; chronic; severe———— 基金项目:苏州市第十六批科技计划项目(SZD0343)作者单位:215007苏州市第五人民医院肝病研究所(童福易);苏州大学附属第一医院(甘建和)通讯作者:童福易,E-mail: tongfy@163.com 电话:0512-68672297甘露糖结合蛋白(mannose binding protein,MBP) 或甘露糖结合凝集素(mannose binding lectin,MBL),是一种钙依赖性糖结合蛋白,属于凝集素家族,广泛存在于人的肝脏和血液中,MBP是第一个被发现具有防御功能的C型凝集素,结构类似补体成分C1q,是天然免疫(innate immunity)的机体防御分子(host defense molecule), 在宿主免疫防御中发挥重要作用。HBV的HBsAg上具有丰富的甘露糖末端的碳氢链,可能是供MBP结合的靶位,故可通过血清MBP与HBV的结合而进行调理作用。MBP-HBV复合物可被补体中和,还可能通过补体受体或直接通过细胞表面MBP受体从血液中清除。并且因此增强从外周血中清除HBV的能力[1]。但是,MBP基因在乙型肝炎中易产生变异,干扰MBP的二级结构,产生无功能的蛋白质,是血清MBP水平低下和调理缺陷的根本原因。因此,研究的乙肝患者MBP基因变异具有重要的意义。MBP基因定位于10号染色体长臂(10q11.2~q21),其cDNA全长约30kb,有4个外显子。目前所发现的MBP基因结构区变异均为第一外显子的点突变,分别为密码子52(CGT→TGT)、54(GGC→GAC)和57(GGA→GAA)。重型乙肝是机体在HBV等多种致病因子作用下,肝细胞在短期内的广泛变性、坏死所致的肝功能衰竭的一类综合征,病情重、发展快、并发症多、病死率高,具体发病机制不很清楚,但遗传因素可能是影响重型乙肝的发生发展及预后的重要因素之一[2]。MBP基因突变与重型乙肝的关系国内尚未见报道,因此有必要对乙肝患者中的MBP基因变异进行相关性研究和探讨。1 资料与方法1.1研究对象 114例乙型肝炎患者,来源于2003年6月~2004年12月苏州市第五人民医院和苏州大学附属第一医院的住院患者。诊断符合2000年西安会议修订的病毒性肝炎诊断标准[3]。其中慢性肝炎52例,重型肝炎62例;男性62例,女性52例;年龄18~65岁。并以64例健康体检人作为对照。以上各组资料均具有可比性。所有病例排除其它病毒感染和肿瘤及自身免疫病,未使用过免疫制剂。收集EDTA抗凝血2ml供提取基因组DNA备用。1.2 试剂及仪器1.2.1试剂 MBP基因第一外显子扩增引物为p1:5'-GTAGGACAGAGGGCATGCTC-3’;p2:5-CAGGCAGTTTCCTCTGGAAGG-3’,由上海生工公司合成,扩增片段包含密码子52、54和57; PUREGENETM全血基因组DNA(gDNA)抽提试剂:美国GENTRA公司产品;全血gDNA纯化试剂:宁波中鼎生物技术公司;Ready-to-use PCR Kit:加拿大BBI公司产品;CEQTMDTCS-Quick Start Mix、Glycogen、CEQTMSample Loading Solution(SLS)、CEQTMSEPARATION BUFFER和MINERAL OIL: 美国Beckman-Coulter公司产品;MinEuteTMPCR Purification Kit:德国QIAGEN公司产品;100mMEDTA和3MNaOAC:本研究所配制;无水乙醇:常州武卫试剂厂。1.2.2 仪器 ZWF-1型紫外透射发射分析仪:上海金达生化仪器厂;FS 600电泳仪:上海复生生物工程研究所;TGL-16G台式高速离心机,上海医用分析仪器厂;Sigma 3k-15 高速冷冻离心机,德国Sigma公司产品;GeneAmp9600基因扩增仪, 美国Applied Biosystems 公司生产。CEQTM8000基因测序仪,美国Beckman-Coulter公司产品。1.3 实验方法1.3.1 基因组DNA的提取 全血gDNA的提取按试剂盒说明书操作。1.3.2 MBP基因的扩增 ①吸取gDNA模板3ul,加入PCR Kit中的Mix(含p1、p2、Taq DNA Polymerase、dNTP、Mg2+等)中,反应体系30ul,置GeneAmp9600基因扩增仪进行扩增。扩增条件为94℃预变性5min后,94℃变性30sec,56℃退火40sec,72℃延伸5min,循环35次,最后4℃保存。②取扩增产物5ul加入含有溴乙锭(0.5ug/ml)的2%琼脂糖凝胶,并设置DNA Marker,90V电泳15min。用紫外透射发射分析仪鉴定产物质量。③将扩增产物加入QIAquick纯化柱,按试剂盒说明书进行纯化。纯化产物即可用于测序反应。1.3.3 DNA序列分析 ①取纯化产物、DTCS Mix、测序引物p1或p2及ddH2O若干配成20ul反应体系,置GeneAmp9600基因扩增仪进行测序反应(标记)。反应条件为96℃20sec, 50℃20sec, 60℃4 min, 循环30次后4℃保存。②标记产物加EDTA和NaOAC及Glycogen以终止,加60ul95%冰乙醇,14000rpm4℃离心20min,70%乙醇洗涤两次,空干。③加25ulSLS溶解,转移至96孔上样板,加MINERAL OIL后置CEQTM8000基因测序仪进行DNA测序。测序仪可自动变性、自动取样,采用毛细管电泳、激光探测荧光,计算机用Run、Sequencing、Investigator软件进行处理,并与GenBank中标准序列(ACCESSION:AF080508 GI:3420793)进行比较分析。1.4 统计方法率的比较采用X2检验,并计算比值比(OR)及其95%可信区间(95%CI)。2 结果MBP基因第一外显子密码子52、54和57中,密码子52、57均未发现突变,仅存在密码子54突变:GGC→GAC, 即G54D,为错义突变。MBP基因DNA序列代表图谱见附图。健康对照、慢性乙肝和重型乙肝三组密码子54突变率见表1。表1 三组MBP基因密码子54突变率-------------------------------------------------------------------------------------------------------------分 组 例数 突变型GAC(%) 野生型GGC(%) -------------------------------------------------------------------------------------------------------------Ⅰ 健康对照组 64 9(14.1) 55(85.9)Ⅱ 慢性乙肝组 52 8(15.4) 44(84.6)Ⅲ 重型乙肝组 62 22(35.5) 40(64.5)合计 178 39 139-------------------------------------------------------------------------------------------------------------注: 三组总体比较,χ2=10.27,P<0.01. 而Ⅲ与Ⅰ比较,χ2=7.79, P<0.01, OR=3.36, 95%CI (1.44-7.85);Ⅲ与Ⅱ比较,χ2=5.89,P<0.05, OR=3.03, 95%CI (1.23-7.44); Ⅱ与Ⅰ比较,χ2=0.04, P>0.053 讨论 我国乙型肝炎病毒(HBV)自然感染率高达42.4%~80.7%,而转归差异大,可以为不受感染、暴发性肝炎、自限性肝炎或慢性感染以致进展成为肝硬化及肝癌,这种HBV感染自然史多样性的原因除与病毒的毒力外,与宿主对HBV感染的敏感性,即与宿主的遗传多态性也有一定的关联。MBP为天然免疫防御分子,在宿主免疫防御中发挥重要作用:(1)可以屏蔽致病原入侵,同时也是激活补体MBL途经的关键成分,使得它从而构成人体首道防线。(2)能识别并结合以甘露糖残基和(或)N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylylucosamine,NG LcAc)为末端糖基的糖蛋白,该结构在微生物或异种抗原表面分布广泛。它能识别病毒、细菌和真菌等。MBP与致病原表面结构结合后,可以通过与吞噬细胞胶凝集素受体(Collectin receptors)结合而发挥直接调理作用,促进致病原被清除。(3)有研究认为MBP还可能参与了循环免疫复合物的清除。由于它能够激活补体系统和吞噬作用使得它从而构成人体的首道防线。因此,MBP基因变异的研究具有重要的意义。我们的研究显示,在该地区人群中,MBP基因仅存在密码子54突变,未发现密码子52、57的突变。密码子54突变率,慢性乙肝组与健康对照组相比无统计学差异(P>0.05),而重型乙肝组则分别显著高于前两组〔χ2=7.79,P<0.01,OR=3.36,95%CI(1.44-7.85),χ2=5.89,P<0.05,OR=3.03,95%CI (1.23-7.44)P<0.05〕。因此,MBP基因在我国仅存在密码子54突变。该突变与HBV的持续性感染无明显相关性,其原因为中国等亚洲人HBV感染慢性化的最重要因素在于胎儿期或儿童早期的病毒感染,在获得母体经胎盘分泌的HBeAg后,诱导了T细胞耐受,且感染的innoculum较大,在此机制下,婴幼儿的感染就成为了持续性感染[4]。而与重型肝炎的发生有关,其原因可能为:MBP基因产生变异,干扰了MBP的二级结构,产生无功能的蛋白质,导致血清MBP水平低下和调理缺陷,不能有效清除HBV及循环免疫复合物,大量免疫复合物沉积在肝脏,引起超强的免疫应答,造成肝细胞大量水肿坏死,从而导致重型肝炎的发生。Hakozaki等[5] 研究了MBP与HBV感染引起的暴发性肝衰竭预后的关系表明,存活者密码子54突变率(13%,3/23)比非存活者(40%,8/20) 低(P=0.043)。Yuen等[6]对香港人群的研究认为,乙肝患者血清MBP水平较正常人低下,MBP密码子54突变与慢性HBV感染者的疾病进展相关。Chong等[7]的研究也证实:HBsAg携带者中,低水平MBP与肝硬化及肝癌的发生有关。故监测MBP密码子54可作为肝炎患者病情预后的判断指标之一。不断明确重型肝炎的发生有着极为复杂的机制,寻找确切的病情预后判断指标以早期诊断早期治疗是为提高重型肝炎防治水平的重要手段和方向。参考文献1 Tong FY,Ma Xin,Zhu CW. MBP gene mutation and the relationship between infectious disease research progress. Foreign Medical Molecular Biology volumes,2003;25(2):140~143.[童福易,马欣,朱传武。MBP基因突变与感染性疾病的关系的研究进展。国外医学分子生物学分册 2003;25(2):140~143]2 Summerfield JA,Sumiya M,Levin M,et al. Association of mutations in mannose binding protein gene with childhood infection in consecutive hospital series. BMJ. 1997;314(7089):1229-12323 Chinese Medical Association.The strategy of prevention and cure in viral hepatitis.Chin J Infect Dis,2001;19:56~62.[中华医学会传染病与寄生虫病分会、肝病学分会联合修订.病毒性肝炎防治方案。中华传染病杂志 2001,19:56~62]4 Millich DR,Jones HE,Hughes JL,et al.Is a funtion of secreted HBe antigen to induce immunologic tolerance in utero.Proc Natl Acad Sci U S A.1990;84:6599~66035 Hakozaki Y,Yoshiba M,Sekiyama K,et al. Mannose-binding lectin and the prognosis of fulminant hepatic failure caused by HBV infection. Liver. 2002;22(1):29-34.6 Yuen MF,Lau CS,Lau YL,et al.Mannose binding lectin gene mutations are associated with progression of liver disease in chronic hepatitis B infection. Hepatology. 1999;29(4):1248-1251.7 Chong WP, To YF, Ip WK, et al. Mannose-binding lectin in chronic hepatitis B virus infection. Hepatology. 2005;42(5):1037-1045附图图1 MBP基因DNA序列图谱(54密码子为GGC)图2 MBP基因DNA序列图谱(54密码子为GAC)
根据乙型肝炎病毒(HBV)全核苷酸序列的差异,目前可将HBV分为A、B、C、D、E、F、G、H等8个基因型[1,2]。基因型反映了HBV自然感染史发生的变异特点,是病毒变异进化的结果。自1994年Okamoto[3]等首先报道HBV 基本核心启动子(BCP)ntA1762T/ntG1764A双突变以来,对其临床意义的研究方兴未艾,不同学者结论有所差异。本文旨在探讨HBV基因型与BCP ntA1762T/ntG1764A双突变的相关性。1 材料和方法1.1 研究对象 随机选取苏州市第五人民医院肝病科2007年门诊和住院的68例慢性乙型肝炎患者,HBV DNA检测均为阳性。诊断标准符合2000年西安会议修订的病毒性肝炎防治方案 [4]。其中男性42例,女性26例;年龄15~65岁。所有病例排除其它病毒感染和肿瘤及自身免疫病,未使用过免疫制剂。收集血清标本超低温冰箱保存备用。 1.2试剂及仪器1.2.1 试剂: ①HBV BCP扩增引物为P1:5'-GTAGGACAGAGGGCATGCTC-3’;P2:5-CAGGCAGTTTCCTCTGGAAGG-3’,由上海生工公司合成,扩增片段包含nt1762、nt1764位点;②HBV基因分型荧光PCR检测试剂盒,由杭州博赛基因诊断技术有限公司提供;③DNA测序所需试剂:DNA提取试剂,上海基康生物技术公司;Ready-to-use PCR Kit,加拿大BBI公司产品;CEQTM DTCS-Quick Start Mix、Glycogen、CEQTMSample Loading Solution(SLS)、CEQTMSEPARATION BUFFER和MINERAL OIL,均由美国Beckman-Coulter公司提供;MinEuteTMPCR Purification Kit,德国QIAGEN公司产品;无水乙醇,常州武卫试剂厂;100mMEDTA和3MNaOAC,苏州肝病研究所配制。1.2.2 仪器:Opticon荧光定量PCR仪,美国MJ Research公司产品。ZWF-1型紫外透射发射分析仪,上海金达生化仪器厂;FS 600电泳仪,上海复生生物工程研究所;Sigma 3k-15 高速冷冻离心机,德国Sigma公司产品;GeneAmp9600基因扩增仪, 美国Applied Biosystems 公司生产。CEQTM8000基因测序仪,美国Beckman-Coulter公司产品。1.3 实验方法1.3.1HBV DNA的提取提取HBV DNA模板按试剂盒说明书进行操作。1.3.2.HBV基因分型检测采用HBV特异引物,利用核酸扩增、荧光标记探针,结合Taqman MGB探针技术,按试剂盒说明书操作,最后上样Opticon荧光定量PCR仪检测分析。1.3.3 BCP基因扩增①吸取HBV DNA模板3ul,加入PCR Kit中的Mix(含p1、p2、Taq DNA Polymerase、dNTP、Mg2+等)中,反应体系30ul,置GeneAmp9600基因扩增仪进行扩增。扩增条件为94℃预变性5min后,94℃变性30sec,56℃退火40sec,72℃延伸5min,循环35次,最后4℃保存。②取扩增产物5ul加入含有溴乙锭(0.5ug/ml)的2%琼脂糖凝胶,并设置DNA Marker,90V电泳15min。用紫外透射发射分析仪鉴定产物质量。③将扩增产物加入QIAquick纯化柱,按试剂盒说明书进行纯化。纯化产物即可用于测序反应。1.3.3 BCP DNA序列测定 ①取纯化产物、DTCS Mix、测序引物p1或p2及ddH2O若干配成20ul反应体系,置GeneAmp9600基因扩增仪进行测序反应(标记)。反应条件为96℃20sec, 50℃20sec, 60℃4 min, 循环30次后4℃保存。②标记产物加EDTA和NaOAC及Glycogen以终止,加60ul95%冰乙醇,14000rpm4℃离心20min,70%乙醇洗涤两次,空干。③加25ulSLS溶解,转移至96孔上样板,置CEQTM8000基因测序仪进行DNA测序。测序仪可自动变性、自动取样,采用毛细管电泳、激光探测荧光,计算机用Run、Sequencing软件进行处理分析序列。1.4 统计学方法率的比较采用四格表X2检验。2 结果2.1 HBV基因型分布 68例慢性乙肝标本中,测得B基因型20例(29.4%),C基因型46例(67.6%),B、C混合型1例,非B非C型(其它型)1例。2.2 各基因型BCP ntA1762T/ntG1764A双突变发生率 HBV BCP常见双突变位点,野生型为ntA1762、ntG1764,突变型为nt1762A→T、nt1764G→A。B、C两组基因型突变率比较见表1。除66例B、C两基因型外,另2例基因型的BCP也都为突变型。表1 两组基因型BCP ntA1762T/ntG1764A突变率--------------------------------------------------------------------------------------------------HBV分型 例数 突变型(ntT1762/ntA1764) 野生型(ntA1762/ntG1764) --------------------------------------------------------------------------------------------------B 20 5(25.0%) * 15(75.0%)C 46 24(52.2%)* 22(47.8%)合计 66 29 37--------------------------------------------------------------------------------------------------* 两组比较,χ2=4.179,P<0.053讨论流行病学调查表明,HBV基因型分布存在明显的地区差异性【5】,B基因型与C基因型主要分布在亚洲【6】。我国主要以HBV C型和B型感染为主,南方以B型为主,北方以C型为主,也存在A型、D型及B和C型混合感染。目前认为,不同地区优势基因型反映了HBV自然感染史发生的变异特点,是病毒变异后进化的结果。我们研究苏州地区的结果是B基因型20例(20/68,29.4%),C基因型比例最高,为46例(46/68,67.6%),尚有B、C混合型和非B非C型(其它型)。并不是前所述的南方以B型为主。肖扬等【7】对浙江温州地区966例患者HBV分型研究显示,66.46%为C型,20.49%为B型,B, C混合型为11.08%。欧强等【8】对上海地区部分乙型肝炎患者进行分析表明,C基因型占67.6%,B基因型占31.6%,D基因型1例。谢秀琴等【9】对江苏地区128例乙肝患者分型研究结果显示,该地区主要以C型(61.72%)和B型(37.5%)为主,仅发现1例B、C混合型(0.78%)。由上可知,本研究对于苏州地区乙肝患者HBV分型的结果与国内其他学者的结果基本一致,我国南方地区HBV基因型分布主要是C型和B型感染,但同样是以C型为主。而B、C型比例,B、C混合型所占的比例有所差异,这可能是由于样本差异及实验方法不同所致。HBV的复制是以mRNA为中间体的逆转录复制,由于此过程缺乏校对酶,因此容易发生碱基配对错误,使得HBV基因突变较为频繁。随着对HBV基因型研究的深入,人们发现其基因型与基因变异之间似乎存在一定的相关性。有学者研究发现HBV C基因的基本核心启动子(BCP)T1762/A1764双突变与肝脏疾病的进展相关,而与HBeAg阳性或抗-Hbe阳性状态无关【10】。同时,也有报告认为BCP双突变可以减少前C区和C区的mRNA转录,从而使HBeAg表达受抑制,表现为HBeAg阴性。对于B基因型与C基因型,多数学者认为C基因型的HBV更容易发生BCPT1762/A1764双突变【11,12】。国内房继莲等【13】报告C基因型T1762/A1764双突变率为34.2%,明显高于B基因型的10.0%。我们的研究结果表明,HBV C 基因型发生T1762/A1764双突变率为52.2%,明显高于B基因型的25.0%,具有统计学差异,P<0.05。这与多数学者的结果一致。另外,由于检测方法的差异,可导致BCP突变株和野生株混合感染率的差异。我国HBV感染率高达42.4%~80.7%,而转归差异大,可以为不受感染、暴发性肝炎、自限性肝炎或慢性感染以致进展为肝硬化及肝癌,HBV感染自然史多样性的原因与宿主的遗传背景及病毒的毒力有关【14】。我国患者大多属于难治性乙肝,从一个侧面来说,可能也与以C基因型为主,BCPT1762/A1764双突变率较高,HBV复制能力加强,毒力增加有关。但仍需进行大范围的多中心的严格的病例对照前瞻性研究进一步探讨它们之间的关系。由于基因分子生物学的不断发展,HBV基因型、基因变异与临床的关系将会得到逐步阐明。此有利于乙肝防治水平的进一步提高。 参考文献1 Kimbi GC, Kramvis A, Kew MC. Distinctive sequence characteristics of subgenotype A1 isolates of hepatitis B virus from South Africa. J Gen Virol. 2004 May;85(Pt 5):1211-1220.2 Kao JH, Chen PJ, Lai MY, et al. Hepatitis B virus genotypes and spontaneous hepatitis B e antigen seroconversion in Taiwanese hepatitis B carriers.J Med Virol. 2004 Mar;72(3):363-9.3 Okamoto H, Tsuda F, Akahane Y, et al. Hepatitis B virus with mutations in the core promoter for an e antigen-negative phenotype in carriers with antibody to e antigen.J Virol. 1994;68(12):8102-8110.4 中华医学会传染病寄生虫病学会。病毒性肝炎防治方案。中华肝脏病杂志 2000,8(6):324~3295 Norder H,Hammas B,Lee S D,et al.Genetic relatedness of hepatitis B viral strains of diverse geographical origin and natural variations in the primary structure of the surface antigen.J Gen Virol,1993,74:134113486 Kao JH, Chen PJ, Lai MY, et al. Hepatitis B genotypes correlate with clinical outcomes in patients with chronic hepatitis B. Gastroenterology, 2000,118(3):554-559.7肖扬,周岳进,王开鉴,等. 浙江温州地区1020例乙型肝炎患者HBV基因分型研究。中西医结合肝病杂志,2005,15(1):4142.8 欧强,陈良,唐徐英。上海地区部分乙型肝炎患者乙型肝炎病毒基因型分析。检验医学,2007;22(1):31339谢秀琴,许家璋,李平,等。江苏地区乙型肝炎病毒基因分型及其临床意义。疾病控制杂志,2005,9(2):171-173.10.Kidd A H,Kidd-Ljunggren K.A revised secondary stucture model for the 3’-end of hepatitis B virus pregenomic RNA. Nucleic Acids Res,1996,24:3295330111 Sumi H, Yokosuka O, Seki N,et al.Influence of hepatitis B virus genotypes on the progression of chronic type B liver disease.Hepatology. 2003 Jan;37(1):19-2612 Orito E, Mizokami M, Sakugawa H,et al.A case-control study for clinical and molecular biological differences between hepatitis B viruses of genotypes B and C. Japan HBV Genotype Research Group.Hepatology. 2001 Jan;33(1):218-23.13 房继莲,魏来,李若冰,等。乙型肝炎病毒基本核心启动子及前C区突变与基因型的关系。中华微生物学和免疫学杂志,2004;24(6):421~42514 童福易,甘建和,陆芹,等。甘露糖结合蛋白基因突变与乙型肝炎的相关性研究。中华医学遗传学杂志,2008;25(3):331~333
215007苏州市第五人民医院肝病研究所(童福易吴建鸿 曹文贵 吴兴福 费晓峰 丁龙其 )[摘要]目的:探讨乙型肝炎病毒标志物(HBV-M)与HBV载量(HBV-DNA)的关系,为临床正确诊治提供科学依据。方法:采用免疫发光和荧光定量聚合酶链反应技术分别检测了670例患者血清中的HBV-M和HBV-DNA。结果:HBeAg阳性模式HBV-DNA>5.0e4 cps/ml占96.3%(363/377), HBeAg阴性模式HBV-DNA>5.0e4 cps/ml占74.8%(160/214)。HBeAg阳性模式HBV-DNA载量显著高于HBeAg阴性模式(P<0.05)。1,3,5模式HBV-DNA载量显著高于1,4,5模式(P<0.01)。HBsAg 阴性的模式中:14例HBV-DNA>5.0e4 cps/ml占18.8%(12/64),抗-HBs阳性模式中,HBV-DNA>5.0e4 cps/ml占16.7%(7/42)。结论:HBeAg阳性模式HBV-DNA载量显著高于HBeAg阴性模式。但少数HBeAg阳性模式中病毒水平很低及HBeAg阴性模式病毒水平很高。还存在着HBsAg阴性或/及抗-HBs阳性的HBV感染。故临床上只有将HBV-M与HBV载量检测相结合,才能正确判断病情及预后。 [关键词] 乙型肝炎病毒;聚合酶链反应;荧光定量;酶免疫Relationship between the models of serologic markers and the quantities of virus in patients infected with hepatitis B virusTong Fuyi,Shaowei,Cao Wengui,et al. Department of Infectious Diseases, Suzhou Fifth People’s Hospital, Suzhou 215007[Abstract] Objective To understand the relationship between the models of serologic markers and the quantities of hepatitis B virus (HBV). Methods The serologic markers of HBV in 670 patients were detected by using the enzyme immunoassay and the quantities of HBV in those were measured by using the real-time fluorescent quantitative PCR. Results The HBeAg-positive patients whose copies were more than 5.0e4 /ml accounted for 96.3%,and the HBeAg-negative patients whose copies were more than 5.0e4 /ml accounted for 74.8%.The HBV copies of HBeAg-positive patients were significantly more than HBeAg-negative patients(P<0.05). The HBV copies of anti-HBe-positive patients were significantly less than anti-HBe-negative patients(P<0.01).The HBV-DNA was detected in some HBsAg-negative (anti-HBs-positive or not) patients.Conclusions The HBV copies of HBeAg-positive patients were significantly more than HBeAg-negative patients. However, some HBeAg-positive patients’ HBV copies are very low, and some HBeAg-negative patients’ HBV copies are very high.The HBV-DNA even could be detected in some HBsAg-negative (anti-HBs-positive or not) patients.It is helpful to judge accurately prognosis by testing the serologic marker and the quantities of virus.乙型肝炎病毒标志物(HBV-M)为诊断乙型肝炎感染提供了重要依据,而HBV载量真实反映所感染HBV的数量,二者的关系是乙肝基础和临床研究中颇为关心的问题。由于近年来聚合酶链反应(PCR)技术的飞跃发展使定量PCR(Q-PCR)成为现实。我们采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测了670例HBV感染者的HBV-DNA,探讨HBV-M与HBV载量的关系。1 资料与方法1.1 病例收集:670例均为我院2002年1月至10月的住院患者。所有病例近3个月未使用过特殊抗病毒药物,如干扰素、拉米夫定、α1胸腺素等。收集外周血,分离血清,当天检测或置-20℃保存。1.2 HBV-M的测定:采用美国雅培(Abbort)公司的AXSYMTM自动化免疫发光诊断仪,试剂为Abbort提供的配套试剂,由专人操作。阳性报告方式:HBsAg(S/N)≥2.00;抗- HBs(Miu/ml)≥10.00; HBeAg(S/CO) ≥1.00; 抗- HBeAg(S/CO)≤1.00; 抗-HBc(S/CO)≤1.00。1.3 HBV-DNA的定量测定:采用实时荧光定量PCR法。采用美国AcuGen System TMAG 9900 QRM Guantitation RoboMaster全自动定量PCR仪,试剂为AcuGen System配套试剂,由深圳百雅克泰(Biotronics)公司提供。检测灵敏度为5.0e4cps/ml。1.4 统计学处理:率的比较采用χ2检验。2 结果2.1 病例资料:共670例患者,男性515例,女性155例。男:女为3.3:1,年龄7~72岁,其中15~60岁占89.6%(600/670)。2.2 HBV-M模式:共发现14种HBV-M模式。HBsAg阳性的模式8种共591例,占病例总数的88.2%(591/670),其中1,3,5模式占50.3%(297/591),1,4,5模式占30.6%(181/591)。HBsAg 阴性的模式6种共64例,占病例总数的9.6%(64/670),其中2,4,5模式占34.4%(22/64),4,5模式占23.4%(15/64),2,5模式占21.9%(14/64)。HBV-M全阴性15例。表 HBV-M与HBV-DNA载量的关系Table 1 The relationship between the marker of HBV and the quantities of HBV 乙型肝炎病毒标志物 病例数 HBV-DNA载量 the quantities of HBV(cps/ml) the marker of HBV n <5.0e4(%) 5.0e4~4.9 e6(%) 5.0 e6~4.9 e8(%) >5.0 e8(%) (-) (+) (++) (+++)1,3,5 297 8(2.7) 69(23.2) 124(41.8)△ 96(32.3)▲1,4,5 181 46(25.4) 67(37.0) 55(30.4)△ 13(7.2)▲1,3,4,5 67 4(6.0) 20(29.9) 35(52.2) 8(11.9)1,5 23 6(26.1) 10(43.5) 4(17.4) 3(13.0)1,2,3,5 11 1(9.1) 3(27.3) 4(36.4) 3(27.3)1,2,4,5 9 1(11.1) 4(44.4) 3(33.3) 1(11.1)1,2,3,4,5 2 1(50.0) 1(50.0)1 1 1(100.0)2,4,5 22 18(81.8) 3(13.6) 1(4.5)2,5 14 12(85.7) 2(14.3)2 5 4(80.0) 1(20.0)2,4 1 1(100.0)4,5 15 12(80.0) 1(6.7) 2(13.3)5 7 5(71.4) 2(28.6)全阴Negative 15 14(93.3) 1(6.7)合计total 670 132 186 226 126 * 1:HBsAg,2:抗-HBs,3:HBeAg,4:抗-HBe,5:抗-HBc。△:P<0.05;▲:P<0.012.3 HBV载量:HBsAg阳性的模式中:HBeAg阳性模式HBV-DNA>5.0e4cps/ml占96.3%(363/377),分析HBeAg阴性模式HBV-DNA>5.0e4cps/ml占74.8%(160/214)。 HBeAg阳性模式HBV-DNA载量显著高于HBeAg阴性模式 (χ2=6.07,P<0.05)。对于1,3,5模式,HBV-DNA<5.0e4cps/ml仅占2.7%,而HBV-DNA>5.0e4cps/ml占97.3%(289/297),其中HBV-DNA>5.0e6cps/ml占41.8%(124/297),HBV-DNA>5.0e8cps/ml占32.3%(96/297)。1,4,5模式中,HBV-DNA<5.0e4cps/ml占25.4%,而HBV-DNA>5.0e4cps/ml占74.6%(135/181),其中HBV-DNA>5.0 e6 cps/ml占30.4%,HBV-DNA>5.0e8 cps/ml仅占7.2% 。1,3,5模式HBV-DNA载量显著高于1,4,5模式(P<0.01)。HBsAg 阴性的模式中:14例HBV-DNA>5.0e4 cps/ml占18.8%(12/64),其中1例HBV-DNA>5.0 e6 cps/ml,2例HBV-DNA>5.0e8 cps/ml;抗-HBs阳性模式中,HBV-DNA<5.0e4 cps/ml占83.3%(35/42)。其中2例HBV-M的5种标志同时存在。(见表)3讨论 感染HBV后HBV-M可表现为多种形式。本研究结果发现有14种抗原抗体模式。HBsAg阳性的模式中,最常见的为1,3,5模式(43.0%)。其次为1,4,5模式(40.7%)。HBsAg 阴性模式中,主要为1,5模式(29.1%)和2,4,5模式(27.8%),其次为4,5模式(19.0%)和2,5模式(17.7%)。并发现2例HBV-M均为阳性。 HBeAg是HBV基因组pre-C/C区段的mRNA表达,与HBV-DNA关系密切,故通常HBeAg阳性者病毒复制活跃,传染性强。HBeAg阴性者病毒复制水平低,传染性弱。我们的研究结果亦证实HBeAg阳性者HBV-DNA水平显著高于HBeAg阴性者(P<0.05)。这与多数报道一致[1]。但在HBeAg阳性模式中,仍有3.7%的患者HBV-DNA<5.0e4 cps/ml,可能是由于机体强大的免疫压力对HBV复制的抑制有关,或由于血液中的HBV-DNA整合到肝细胞中而致。在HBeAg阴性模式中,仍有74.8%的患者HBV-DNA>5.0e4 cps/ml,甚至有7.2%的患者HBV-DNA>5.0e8 cps/ml,可能与HBV基因突变有关,特别是pre-C基因或C基因启动子发生突变时,e抗原难以表达,而仍存在病毒复制[2,3]。HBsAg 消失,抗-HBs的产生,多意味着HBV感染的恢复或机体乙肝疫苗接种后产生了保护性作用。本研究结果表明HBsAg阴性、抗-HBs阳性模式中,仍有16.7%的患者HBV-DNA>5.0e4 cps/ml,只是病毒水平多不高,可能与病毒复制水平低有关。HBsAg阴性的HBV感染是几年来临床关注的热点。其原因有:①抗原量过低,未达到可检测水平;②以抗原-抗体复合物存在,当抗体居优势时抗原被掩蔽,试剂盒不灵敏而不能被检出;③HBV-S基因变异,其中主亲水区有些变异不产生HBsAg[4]。可能是因为编码HBsAg的S基因发生变异:S基因“a”决定簇为主要抗原决定簇,此区单个保守的氨基酸替代可改变HBsAg的抗原性。“a”决定簇发生变异则影响整个抗体的应答。故用常规免疫诊断试剂检测出HBsAg,机体产生的抗-HBs并不能中和变异了的HBV。而且HBV存在不同亚型,分布具有地域性,“a”决定簇序列存在多态性[5]。故HBsA与抗-HBs并存并不奇怪,可能由于前后感染两种亚型HBV或S基因变异,原型抗-HBs不能清除抗原性已改变的HBsAg。我们的研究就发现,HBsAg阴性或/及抗-HBs阳性的少部分患者血清中亦存在HBV感染,且HBsAg、HBeAg滴度与HBV-DNA水平相关[6]。另外,抗-HBs检测结果不仅与试剂来源有关,还可能与所接种乙肝疫苗不同来源的差异有关[7]。病毒复制过程中也同时表达包装蛋白,这些异源蛋白(抗原)激发机体免疫系统,产生相应的抗体。因此,抗原抗体反映了病毒的表达水平,也间接反映了病毒复制水平。血清学方法亦可用于乙肝病因分析(病原学诊断)、传染性、疾病进程和预后分析。但HBV的表达和机体的免疫反应的强弱受多种因素的影响,免疫学指标与临床现象及病毒载量有可能不完全符合[8]。由于HBV逆转录酶抑制剂的广泛应用,病毒变异的广泛存在,仅仅依靠免疫学指标已不能完全解释许多临床现象。血清学检测不能完全代替HBV-DNA检测。病毒载量是比血清学更加量化的指标,在反映临床现象及其变化趋势方面比血清学指标可能更加准确和灵敏。但二者不能互相完全替代。故临床检测HBV-M必须同时检测HBV-DNA水平,二者结合才能正确判断病情及预后,若只片面强调一方均有失偏颇。参考文献1 Kessler HH, Preininger S, Stelzl E, et al. 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2008年12月05日 苏州日报 作者: 王姚余 耐药已成为目前乙肝治疗领域最大挑战,统计数据显示,我国目前有超过10万的乙肝患者在治疗时发生耐药。耐药情况一旦发生,抗病毒药物抑制病毒复制能力就会大大降低,引起病情反复,而药物之间的交叉耐药也会给后续治疗带来困难。市五院肝病研究所所长童福易认为,慢性乙肝患者第一次治疗最好选择既强效又低耐药的抗病毒药物。 耐药影响疗效 “原先还治疗得好好的,怎么一下子没用了呢? ”耐药这个难题正困扰着不少乙肝患者,同时也使乙肝治疗面临挑战。 耐药不仅使患者身体再次“受伤”,心理方面的负担也很重。不少患者出现食欲不振、忧心忡忡、失眠等情况。严重的负面情绪会进一步导致患者病情加重,进入恶性循环。据调查,这类患者心理问题的发生率接近100%,其中发生率最高的是焦虑。患者十分担心疾病复发:63.3%的患者担心疾病传染给家人,60%的患者担心工作能力下降,38.3%担心长期治疗造成家庭经济负担,30%担心拖累家人,26.7%担心因患传染病被人远离。 由于耐药可使病毒反弹和病情加重,使患者无法学习、工作、婚育,这不仅对患者,也给家人蒙上了阴影。耐药发生之后,会使治疗费用大大增加,给患者及其家庭带来更为沉重的经济、心理负担。 病毒变异引起 耐药是一个逐渐发生的过程,市五院肝病研究所所长童福易说,病毒耐药主要发生在核苷(酸)类药物治疗慢性乙型肝炎的过程中。一开始,患者体内可能只有少量变异的病毒株。尽管这些病毒对药物抵抗力强,但其复制能力比野生病毒株差。因此,体内的野生病毒株仍占“优势”。随着抗病毒药物的使用,对药物敏感的野生病毒株被打得“落花流水”,而耐药的变异病毒株凭借自己的抵抗力“躲过”了药物 攻击,得到复制机会,成为体内的“优势”株。这时,患者肝功能就会出现反弹,导致临床耐药的发生。 病毒基因变异在自然界中广泛存在,也可由药物诱导产生。因此,从这个角度说,治疗过程中出现病毒变异属于必然。“但这并非灾难,只要积极应对,可以将耐药问题的风险降至最低”童福易说,一旦发生耐药,患者一定要把情况告知专科医生,医生会根据耐药病毒基因测序的结果,为患者选择还没有产生耐药的那些药物进行治疗。 需定期检查 什么是耐药呢?童福易说,患者如果在治疗前期疗效不错,血清乙肝病毒DNA一度被抑制,病毒载量明显下降,但在继续治疗过程中病毒载量又慢慢升上来,与下降的最低值相比升高了10倍以上,并经再次复查证实,这就意味着病毒耐药发生,医学上称之为病毒学突破。 据了解,如果病毒载量突然上升超过2个数量级或是高于治疗前水平,就称为病毒反跳。如果病毒载量慢慢上升的同时,血清转氨酶水平也升至正常水平以上,这说明病毒复制增加的同时,肝脏还发生炎症,医学上称之为生化学突破。 治疗期间,需要定期观察耐药情况,一般来说,检查间隔时间是3个月至半年,主要化验检查血清乙肝病毒DNA水平、耐药基因序列以及肝功能。目前,市五院可以利用PCR扩增乙肝病毒DNA多聚酶基因序列分析等方法,可检测乙肝病毒耐药基因。 用药有讲究 “为预防耐药的发生,治疗一定要选择专科医生”,童福易介绍,治疗首先要使用强效的抗病毒药物,快速持续抑制病毒载量至不可测水平。病毒耐药的发生与病毒抑制程 度密切相关,减少耐药发生率首先是减少血液中病毒的数量,或者尽可能降低病毒载量。病毒复制越低,发生变异的可能性越小,耐药率的发生也就越低。 选择具有高耐药基因屏障的抗病毒药物也很关键。“耐药基因屏障”好比一堵墙,1个位点发生变异的几率大概为5万分之一,而3个位点同时发生变异的几率则在一千万分之一左右。初始治疗应选择抗病毒活性强、低耐药的药物,这已经是当今国际医学界对慢性乙肝治疗的共识。此外,在治疗过程中,如果抗病毒治疗3个月至6个月疗效不明显,需要考虑及时调整方案,更换其他药物治疗;不要用一段时间拉米夫定,又换成阿德福韦,过一段时间又换成恩替卡韦;不要盲目联合用药。 在治疗之前,患者应了解治疗全过程,掌握治疗过程中的注意事项,不要随意停用。